ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН

В 2023 г. сформировали грядки на уже имеющейся на основе договора безвозмездной аренды с 2010 территории: п. Васильковка (2022 год сформирована); и п. Шумный (грядка сформирована в мае 2023 (Приморский край) (рис. 1). Эти районы по климатическим условиям находятся в более подходящих районах для выращивания женьшеня и реже подвергаются негативному климатическому воздействию (наводнения и проливные дожди). В п. Васильковка в мае 2023 на грядку были пересажены корни 1 года по методике (Павленко, Юров, 1975) в количестве 200 шт. На грядку в п. Шумный стратифицированные семена высажены в сентябре 2023. В 2020 году была создана опытная грядка с растениями разных популяции женьшеня п. Васильковка. В средней части грядки была выбрана площадь 120 см на 150 см2 и обработана опытными микробным препаратом, созданным в лаборатории почвоведения и экологии почв ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН для повышения урожайности зерновых культур, состоящим из трех бактериальных штаммов (Pseudarthrobacter equi S2+ Pantoea agglomerans Ф19+ Acinetobacter johnsonii A1). В июле 2023 года были сняты морфометрические параметры растений (рис. 2). Были отобраны 3 популяции корейские красные (КК), дальнереченские (ДР) и уссурийские красные (УСС). На опытном участке 120 х150 см2 взошло 30 растений, в то время как на участке, обработанном бактериальным препаратом, 56 растений. При этом обработанные растения раньше вступили в генеративную фазу: 18 растений сформировало завязи в количестве от 3 до 21 шт., в то время как количество плодоносящих растений на опытном участке было всего три с количеством завязей до 3 шт. (это согласуется с литературными данными Грушвицкий, 1961). Ростовые характеристики в опыте также превышали контрольные по всем трем популяциям и даже отличались достоверно (рис. 2). Несмотря на это, необходимы дополнительные исследования, в результате опыт повторили в 2023 году на вновь созданных грядках с двухлетними растениями разных популяций в п. Васильковка и в п. Шумный в октябре обработали семена (300 шт), высаженные на грядку. За 2023 год участки были обработаны 2 раза (июль, октябрь).   Был проанализирован качественный и количественный состав вторичных метаболитов (гинзенозидов) корней женьшеня, выращенных на плантации (дальнереченская популяция). Кроме того, в работе использовали морфогенные линии женьшеня полученые ранее в лаборатории биотехнологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН из корней дальнереченкской популяции для анализа возможности детекции минорных гинзенозидов. ВР-ВЭЖХ-МС хроматографические профили по полному ионному току показаны на (рис. 3). Первоначально было изучено хроматографическое и масс-спектрометрическое поведение 14 стандартных образцов, из которых 12 (G-Rg1, G-Re, G-Rf, NG-R2, G-Rb1, G-Rg2, G-Rc, G-Ro, G-Rb2, G-F1, G-Rd, G-F2) были ранее выделены и охарактеризованы в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук. Еще два соответствовали двум эталонным стандартам G-Rg3 и G-Rh1 компании “Sigma-Aldrich”. На этом этапе были оптимизированы параметры ВЭЖХ метода, такие как температура термостата аналитической колонки, состав подвижной фазы и профиль градиентного элюирования. Муравьиная кислота, используемая как добавка к подвижной фазе, не только улучшила разрешение и форму хроматографических пиков, но также усилила ионизацию, вызвала образование ионов-аддуктов, что облегчило обнаружение и подтверждение молекулярного иона. Для идентификации компонентов экстрактов было решено использовать масс-спектрометрию высокого разрешения (с ошибкой определения брутто-формулы не более 8 мДа) с одновременной регистрацией отрицательных и положительных ионов (хромато-масс-спектрометр Shimadzu LCMS-IT-TOF). В режиме полного сканирования гинзенозиды определялись как депротонированные ионы [M-H]- и ионы – аддукты с муравьиной кислотой [M+HCOO]- (всегда для нейтральных гинзенозидов). Это часто подтверждалось обнаружением натриевых аддуктов [M+Na]+ (табл. 1, Дополнительные материалы), причем соотношения интенсивностей молекулярных ионов и ионов-аддуктов были индивидуальны для каждого компонента и сохранялись от анализа к анализу. Отрицательный режим сканирования оказался более чувствительным, тогда как МС/МС спектры показали больше информации о фрагментации ионов предшественников состава [M-H]- и/или [M+HCOO]-. Для получения МС/МС спектров в настоящем исследовании использовали масс-спектрометрию низкого разрешения (масс-спектрометр низкого разрешения Bruker HCT ultra, функционирующий в режиме регистрации отрицательных ионов и автоматическом выборе ионов-прекурсоров), благодаря его высокой чувствительности и хорошо различимым масс-спектрам в этом режиме. Характерный путь фрагментации стандартных образцов был полностью изучен и продемонстрировал картину, как правило, соответствующую последовательной потере гликозидных остатков до образования ионов сапогенина/агликона (Agl) [Agl-H]-. Условия фрагментации были оптимизированы таким образом, чтобы получить сигнал ионов сапогенина для каждого компонента за один цикл анализа. Соответственно различные группы гинзенозидов хорошо дифференцировались и характеризовались при помощи МС/МС спектров. Основные группы гинзенозидов, обнаруженных в экстрактах ‒ производные протопанаксадиола (PPD-тип), протопанаксатриола (PPT-тип) и олеаноловой кислоты (Ole-тип). При МС/МС-фрагментации эти гликозиды продуцировали ионы сапогенинов: [PPD-H]- с m/z 459 (C30H51O3), [PPТ-H]- с m/z 475 (C30H51O4) и [Ole-H]- с m/z 455 (C30H47O3), соответственно. Также сахарные цепочки легко идентифицировались путем определения молекулярной массы последовательных нейтральных потерь от ионов [M-H]- (и/или [M+HCOO]-) до ионов сапогенина [Agl-H]-, обычно это 162, 146, 132 и 176 Да, что в основном соответствует элиминированию дегидрированных остатков глюкозы (Glc), рамнозы (Rha), пентозы (Pent), арабинопиранозы (Arap), арабинофуранозы (Araf) или ксилозы (Xyl) и глюкуроновой кислоты (GlcA), соответственно. Необходимо отметить, что существует множество изомерных форм гинзенозидов. В частности, в изученных образцах были выявлены несколько гликозидов, которые имели близкие (в пределах ошибки в 8 мДа) значения m/z и идентичную молекулярную формулу. Только с помощью анализа МС/МС для этих гликозидов удалось выявить различия в структуре и провести их разграничение на основании гипотетического строения агликонов. Примечательно, что некоторые тритерпеновые гликозиды типа окотиллола (Oct-тип) также были обнаружены и идентифицированы в исследованных образцах. МС/МС спектры соединений № 6, 10 и 15 содержали сигнал иона с m/z 491 (C30H51O5), соответствующий депротонированному агликону окотиллолового типа [Oct-H]-. Также восемь производных олеаноловой кислоты были обнаружены в исследуемых экстрактах (пики 34, 35, 41, 47, 52, 64, 65, 67). В режиме полного сканирования гинзенозиды типа Ole обнаруживали интенсивные сигналы депротонированных ионов [M-H]- и натриевых аддуктов [M+Na]+. В результате всей проделанной работы в неочищенных экстрактах суммарных образцов нативных корней и морфогенных линий P. ginseng были идентифицированы 66 гинзенозидов, из которых 13 компонентов (пики № 7 (G-Rg1), 8 (G-Re), 21 (G-Rf), 24 (NG-R2), 26 (G-Rb1), 28 (G-Rg2), 31 (G-Rh1), 32 (G-Rc), 35 (G-Ro), 37 (G-Rb2), 48 (G-F1), 50 (G-Rd) и 63 (G-F2)) были идентифицированы путем сравнения их хроматографического и масс-спектрометрического поведения с эталонными стандартами, а остальные соединения были определены путем сравнения эмпирических молекулярных формул, а также информации о фрагментации и последовательности их удерживания на обращенной фазе с данными из литературы. Все хроматографические и масс-спектрометрические данные, использованные для идентификации, собраны в табл. (Дополнительные материалы, опубликовано Горпенченко и др., 2023). На основе идентификации был проанализирован качественный состав разделенных образцов в сравнении с образцом, полученным из нативных корней. Качественный состав плантационных корней и корней в культуре ткани практически совпадал и был представлен 47 соединениями. Базальный каллус PgR-calli содержал 50 гинзенозидов, представленных в плантационных и культивируемых in vitro корнях, при этом корни in vitro содержали более разнообразные формы Ole-типа соединений (пик № 41, 47, 52, 65, 67), не обнаруженных в плантационных корнях. Самым бедным по разнообразию гинзенозидов являлся морфогенный базальный каллус, из которого формировались листья. В нем было найдено всего 35 гинзенозидов. При этом он содержал достаточно редкие для нативных корней гинзенозиды олеанолового и окатиолового типов (рис. 4). Для изучения распределения индивидуальных гинзенозидов в нативных корнях и различных тканях, и органах морфогенных клеточных линий был использован полуколичественный анализ с применением метода внешней калибровки относительно стандартных образцов гинзенозидов G-Rg3 и G-Rh1. Результаты представлены на рис. 4. Суммарное содержание гинзенозидов в плантационном 6-летнем корне и клеточных линиях составляло: в интактных корнях – 18.13 ± 2.72 мг/г сухого веса.  в корнях ризогенной клеточной линии – 17.24 ± 3.45 мг/г сухого веса; в базальном каллусе ризогенной клеточной линии 18.29 ± 2.74 мг/г сухого веса; в листьях геммогенной линии – достигало достоверно максимальных значений 26.65 ± 4.78 мг/г сухого веса; в базальном каллусе геммогенной клеточной линии было достоверно минимальным – 8.26 ± 1.07 мг/г сухого веса (рис. 3). Кроме общего содержания гинзенозидов, было проанализировано соотношение типов PPD и PPT (PPD/PPT) и соотношение нейтральных гинзенозидов к малонил-гинзенозидам (табл. 1). Установлено, что соотношение PPD-типа и PPT-типа гинзенозидов было близко к единице, что отражало примерно равное количество данных веществ во всех образцах, за исключением инициального каллуса, формирующего листья (PgG-calli). В этом образце (PgG-calli) производные протопанаксадиола практически отсутствовали и были представлены только 4 гинзенозидами (рис. 4), при этом 3 из них находились в малонилированной форме (m-PPD). Интересен и тот факт, что содержание малонил-эфиров гликозидов протопанаксадиола было одинаково с нейтральными формами этих соединений, в то время как малонилированные производные протопанаксатриола встречались в существенно меньшем количестве (рис. 4). Необходимо отметить, что морфогенные клеточные линии повторяют не только паттерн качественного состава гинзенозидов, по сравнению с отдельными частями нативных корней, но и увеличивают их разнообразие и количество, часто за счет накопления промежуточных соединений. При этом, несмотря на то, что в нативных корнях редко наблюдают наличие редких гинзенозидов, в плантационном корне было отмечено присутствие всех групп соединений.   3. Объектами исследования являлись образцы, отобранные с почвы, корней и листьев женьшеня (Panax ginseng C.A. Mey) из разных мест произрастания. В работу было взято 2 образца: образец почвы, ризосферы и ризопланы растения, растущего под пологом леса, более 15 лет (контрольный образец №4); образец № 11 - почва, ризосфера и ризоплана растения дальнереченской популяции на контрольном участке опытной грядки. Для микробиологических исследований образцы почвы отбирали стерильными инструментами и помещали в стерильный упаковочный материал согласно ГОСТ 17.4.4.02-84. Образцы были упакованы в сумки-холодильники и доставлены в лабораторию для незамедлительного исследования. В лабораторных условиях образцы, собранные под пологом леса, где растения женьшеня произрастают уже более 15 лет и образцы с грядки на которой проводится эксперимент, подвергались стандартной методике выделения чистых культур микроорганизмов.  Образцы почв, ризосферы, ризопланы корней высевали на агаризованные питательные среды (ГРМ-агар – для аммонификаторов; крахмало-аммиачный агар – для бактерий, использующих минеральные формы азота; Эшби – для бактерий, способных к азотфиксации, минимальную селективную среду по Дунайцеву – для бактерий способных к фосфатрастворению; Сабуро – для выделения грибов; Александрова – для силикатных бактерий) для получения наибольшего разнообразия чистых культур микроорганизмов. Всего было выделено и отправлено на хранение 109 штаммов микроорганизмов, среди которых 48 – грибы и 61 – бактерии  (рис. 5). Для определения морфологии клеток и типа клеточной стенки бактериальных изолятов применяли метод окраски по Граму. Всего в коллекции оказалось 61 штамм, из них 39 штаммов грамположительных и 22 - грамотрицательных. Отмечая морфологические особенности, можно сказать, что большинство анализируемых микроорганизмов имеют форму палочек разнообразной длины, среди которых также имелись два грам положительных спорообразующих штамма. Преобладали мелкие грам положительные и грам отрицательные палочки. Было выявлено 3 штамма, имеющих форму кокков, среди которых один штамм имел форму диплококков. Наблюдались штаммы микроорганизмов, в которых палочки являются одиночными (4 грам положительных, 8 грам отрицательных), в которых палочки собираются по двое (5 грам положительных, 4 грам отрицательных), в которых палочки собираются по трое и более (3 грамположительные). В результате исследования была создана коллекция штаммов микроорганизмов почвы женьшеня (рис. 5). Геномную ДНК из культур бактерий выделяли с помощью коммерческого набора “НК-сорбент Base” (Литех, Россия) согласно протоколу производителя. Анализ фрагмента гена 16S рРНК проводили с использованием набора реагентов фирмы Биолабмикс “БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2×)” (Россия) и универсальных бактериальных праймеров 27F (5’–AGAGTTTGATCATGGCTCAG–3’) и 1350R (5’–GACGGGCGGTGTGTACAAG–3’) (Lane et al., 1985). Амплификацию осуществляли на приборе “Т100 Thermal Cycler” (BioRad, США) в следующем режиме: 94°C – 4 мин (1 цикл); 94°C – 60 сек, 48°C – 60 сек, 72°C – 90 сек (5 циклов); 92°C – 60 сек, 50°C – 110 сек, 72°C – 90 сек (10 циклов); 92°С – 60 сек, 52°С – 60 сек, 72°С – 60 сек (10 циклов); 92°C – 60 сек, 54°C – 60 сек, 72°C – 110 сек (10 циклов); 72°C – 10 мин (1 цикл) (Денисова и др., 1999). Полученные ПЦР-продукты разделяли в электрофорезной камере (при напряженности поля около 2 В/см) в 1% агарозном геле с добавлением этидиум бромида, результаты учитывали на трансиллюминаторе под ультрафиолетовым излучением. Для очистки продуктов амплификации от остатков реакционной смеси использовали набор ExoSAP-IT Express (Thermo FS, США). ПЦР-продукты секвенировали по методу Сэнгера, используя набор реактивов “Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit” (Thermo FS, США) для подготовки нуклеотидных последовательностей к прочтению на генетическом анализаторе Нанофор 05 (Синтол, Россия). Филогенетический анализ осуществляли путем поиска гомологичных последовательностей в международном банке данных (GenBank) с помощью программы BLAST (Altschul et al., 1997) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей выполнено в редакторе BioEdit; для выравнивания последовательностей использовали алгоритм программы CLUSTAL W (http://www.genebee.msu.su/clustal). Филогенетическое дерево построено с использованием метода ближайших соседей (neighbor-joining) на основе алгоритма Kimura two-parameters в программе MEGA 7 (Kumar et al., 2016). Показатель достоверности порядка ветвления определяли на основании bootstrap – анализа 100 альтернативных деревьев. Была выделена ДНК и секвенирован фрагмент гена 16S РНК по Сенгеру для идентификации всех полученных штаммов микроорганизмов двух образцов: растений, выросших в естественных условиях, под пологом леса и культивируемых растений, выросших на грядках. По результатам секвенирования и морфологическим данным всего было идентифицированно 44 штамма бактерий. Построены филогенетические деревья (Рис. 6, 7). Можно отметить, что самым часто встречающимся родом микроорганизмов является Pseudomonas. Данный род встречается повсеместно, а в рамках нашей работы отмечено, что представителей данного рода оказалось больше всего в ризосфере плантационного женьшеня. Считается, что ризосферные микроорганизмы служат важными индикаторами функции почвы. В месте прилегания корней ризосферы к почве растений происходят сложные биологические и экологические процессы, включая круговорот питательных веществ, развитие патогенеза и защиту растений эндофитными микроорганизмами. Микробное сообщество ризосферы может иметь важные последствия для роста, питания и здоровья растений в агроэкосистемах. К штаммам, предполагающим дальнейшее исследование, относится Sphingomonas paucimobilis. Он является условно патогенным и в рамках нашей работы может играть ключевую роль. Штамм КП4ПА2 идентифицировать на данном этапе не удалось. Также следует сказать, что в результате идентификации многие штаммы микроорганизмов оказались повторяющимися. Дальнейшее исследование предполагает расширение коллекции анализируемых штаммов и их сбор не только с корня женьшеня, но и со стеблей, почвы и отпечатков листьев. Необходимо проведение тех же методов исследования, а также построение филогенетического дерева в рамках рассмотрения анализируемых микроорганизмов. Образец корня женьшеня с плантационной грядки содержит в микрофлоре почвы значительно большее количество штаммов бактерий, чем образец, произрастающий под пологом леса. Штаммами микроорганизмов, которые встречаются в почве у каждого образца, являются только Pseudomonas koreensis, микроорганизм, обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным видам микромицетов, активно распространен в ризосфере сахарного тростника и в насыпной почве и Lysinibacillus fusiformis, облигатный анаэроб, который также выделяют из корней яблони в северной Италии, обладает противогрибковой активностью в отношении различных грибковых патогенов. При изучении таксономического положения изолятов бактерий, выделенных из почв под пологом леса и грядок; ризосферы и ризопланы корней женьшеня выявлено, что подавляющее большинство бактерий относилось к филуму Bacillota рода Bacillus (рис. 6, 7, 8). Минимальное разнообразие культивируемых бактерий было выявлено в образце №4 взятом из-под полога леса. Штаммы 54, 56, 57 имели высокую степень родства (99.73%, 99.07%, 99.55%, соответственно) с гомологами OP810793 Bacillus sp. (Индия), MF111955 (Китай), LC202628.  Bacillus sp. (Бангладеш), соответственно. И характеризовались как мелкие грамположительные палочки. Они присутствовали во всех исследуемых образцах. Отличительными штаммами для образца с грядки являются Bacillus thuringiensis – почвенная бактерия, образующая споры во время стационарной фазы своего цикла роста. Споры содержат кристаллы, преимущественно содержащие один или несколько белков Cry и/или Cyt (также известных как δ-эндотоксины), которые обладают мощной и специфической инсектицидной активностью. Erwinia sp – фитопатоген, поражающий надземные и подземные части растений, первоначально выделен в Японии из грушевых деревьев с симптомами бактериального ожога побегов. Pseudomonas mohnii – бактериальный эндофит, принадлежит к основным сообществам корневого микробиома томата, обладает антимикробной активностью, Lysinibacillus parviboronicapiens – почвенная спорообразующая бактерия, наблюдается также в почве района Хисарджик в провинции Кютахья, Турция. Pseudomonas fragi– протеолитическия психротолерантная бактерия. В последние несколько десятилетий во всем мире с P. fragi были связаны многочисленные проблемы с порчей пищевых продуктов, при этом пораженные продукты, включая охлажденное мясо, хранились в аэробных условиях, в вакууме и в условиях модифицированной атмосферы. Lysinibacillus sphaericus – почвенная бактерия, обладающая инсектицидной активностью против личинок комаров. Rahnella sp.  – род бактерий, широко распространенный в окружающей среде (вода, почва, ризосфера сельскохозяйственных культур, кишечник улиток) и иногда выделяющийся из пищевых продуктов и клинических образцов человека. Продуцирует стимулирующие рост растений вещества, такие как индол-3-уксусная кислоту, сидерофор, 1-аминоциклопропан-1-карбоновую дезаминазу, а также солюбилизированный неорганический фосфат. Pseudomonas putida – распространенная почвенная бактерия, синтезирующая фитогормон – индолуксусную кислоту (ИУК). Отличительными штаммами для образца почвы корня женьшеня, собранного под пологом леса, являются Lysinibacillus boronitolerans – спорообразующая бактерия, являются потенциальными средствами биологической борьбы с болезнями, поражающими какао. Обычно встречается в почве и была выделена из тканей растений, из ферментированных продуктов семян растений и даже из образцов печени иглобрюха. Sphingomonas paucimobilis – представляет собой грамотрицательную палочку, не ферментирующую глюкозу, которая широко распространена в природной среде. Для людей является патогеном и может вызывать инфекции как у здоровых людей, так и у людей с ослабленным иммунитетом. Хотя это микроорганизм с низкой клинической вирулентностью, инфекция, вызванная S. paucimobilis, может привести к септическому шоку. Stenotrophomonas rhizophila – бактерия, широко распространенная в ряде мест, связанных с растением хозяином, от стеблей, листьев или ризосферы, до корней и почвы. S. rhizophila способен окислять важный элемент корней растений – ксилозу и обладает противогрибковыми свойствами, Pseudomonas baetica – грамотрицательная бактерия, первоначально выделеная из печени больной морской камбалы. Является патогеном. Генотипический и фенотипический анализы данного штамма показывают, что он устойчив к осмотическому стрессу и окситетрациклину.   Помимо образцов почвы, которые были использованы для анализа микробного состава, исследовали образцы почв, отобранные с грядок с различным возрастом культивирования растений женьшеня от 4 до 20 лет. Всего было взято 11 образцов почвы на которых произрастали растения женьшеня: №1 - красноплодные растения Корея (КК), №9 - корея желтоплодный (КЖ), №3 китайская популяция (КП), №2 уссурийская популяция (УСС), №6 уссурийская популяция, где растения росли 4 года (УСС4), №7 хасанская популяция (ХП), №8 синегорская популяция (СГ), №10 дальнереченская популяция (ДР), №11 дальнереченская популяция (ДР4); №4 почва из тайги (контроль полог леса 1 (ПЛ1)), №5 почва из тайги (контроль полог леса 2 (ПЛ2)) (табл. 1). Реакция среды почвенного раствора (рН) определялась в соответствии с рекомендациями ГОСТ 26423-85 (Почвы. Методы определения удельной электрической проводимости, рН и плотного остатка водной вытяжки) и ГОСТ 26583-85 (Почвы. Определение рН солевой вытяжки, обменной кислотности, обменных катионов, содержания нитратов, обменного аммония и подвижной серы методами ЦИНАО). Уровень реакции среды почвенного раствора в каждом анализируемом образце определялся в 3-х-кратной аналитической повторности. Показатель pH H2O отражает актуальную кислотность почвенного раствора. Основная масса образцов почв грядок (№ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 11) имеет слабокислую реакцию среды. Кислотность образцов почв с грядок № 7, 8 характеризуется как нейтральная. По значению обменной кислотности (pH KCl) образцы почвы № 1, 2, 3, 4, 5 относятся к кислым, образцы почвы № 6, 9, 10, 11 к среднекислым, образцы почвы с грядок № 7, 8 к слабокислым (табл. 1). Элементный состав почвенных образцов определялся методом энергодисперсионной рентгенфлуоресцентной спектроскопии (EDX). Определение содержания элементов проводили на анализаторе EDX 800HS-P (Shimadzu, Япония) оснащенным родиевым катодом в формате количественного анализа, в вакуумной среде с использованием государственных стандартных образцов сравнения (ГСО 901-76, ГСО 902-76, ГСО 903-76, ГСО 2498-83, ГСО 2499-83, ГСО 2500-83, ГСО 2507-83, ГСО 2509-83). Параметры измерения: напряжение – 50 kV, сила тока – 100 mA, время определения – 300 с, "мертвое" время – 20%, размер коллиматора – 10 мм.  Среднее содержание элементов, рассчитанное из значений, полученных для 3-х аналитических повторностей измерения каждого опытного почвенного образца приведено в Таблицах 2, 3. В работе были использованы методики: М-02-0604-2007. Методика выполнения измерений массовой доли кремния, кальция, титана, ванадия, хрома, бария, марганца, железа, никеля, меди, цинка, мышьяка, стронция, свинца, циркония, молибдена, в порошковых пробах почв и донных отложений рентгеноспектральным методом с применением энергодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометров типа EDX фирмы Shimadzu. Свидетельство об аттестации МВИ № 242/84 – 2007; ПНД Ф 16.1.42-04 (издание 2010 г.) Методика выполнения измерений массовой доли металлов и оксидов металлов в порошковых пробах почв методом рентгенофлуоресцентного анализа. Было определено общее (валовое) содержание элементов в образцах почв. Cодержаниe макроэлементов в почвенных образцах соответствует уровню содержания элементов в органических горизонтах почв буроземного ряда (табл. 2). Содержание макроэлементов и общих форм углерода (Собщ) в представленных семи почвенных образцах №2-5,8,9,11 соответствует уровню содержания элементов в гумусово-аккумулятивных и переходных к минеральным горизонтам зональных типов почв Приморского края, не используемых в сельскохозяйственном производстве. Образец почвы с грядки № 3 отличается от всех остальных более высоким содержанием C, MnO и Fe2O3. но, в целом ни какого превышения по содержанию макроэлементов в почвах, относительно почв дальневосточного региона, не обнаружено (табл. 2). Содержание большинства исследованных микроэлементов указывает на превышение среднего регионального значения, что указывает на повышенный уровень их содержания в опытных образцах (табл. 3). При таком уровне содержании Cu в почвах необходимо обратить внимание на процессы проявления фитотоксичности у выращиваемых растений (у высших растений это может выражаться в угнетении роста, отмирании почек и т,д.). Содержание Cu превышает уровень среднерегионального значения до 30,5 раз, что говорит об использовании медного купороса для травли грибковых заболеваний на грядках. Высокое превышение отмечено в образцах с грядок № 1-3 и № 6-11. Содержание Rb превышает уровень среднерегионального значения в 1,7-2,4 раза, концентрация Cr, Co и Zn в 1,2–1,8 раз, уровень Sr и Zr в 1,1-1,3 раза. Таким образом, исходя из данных о химическом составе почв грядок можно утверждать, что они уже более 20 лет бесконтрольно используются в сельхоз. обращении. Повышенное содержание Rb и Zr, как правило, не оказывает значительного влияния на питание растений, так как эти элемегты содержатся в составе первичных почвенных минералов. Все остальные элементы оказывают активное влияние на питание растений и поступают через корни в растительные ткани.

В 2024 г. продолжились эксперименты по влиянию бактериального препарата (БП) лаборатории почвоведения и экологии почв ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН созданного для повышения урожайности зерновых культур и состоящего из трех бактериальных штаммов (Pseudarthrobacter equi S2+ Pantoea agglomerans Ф19+ Acinetobacter johnsonii A1) на всходы и растения женьшеня, а также почвы на которых культивируется женьшень. Всхожесть стратифицированных семян, посаженных в мае 2024 года на участке в Чугуевском районе в 2024 году составляла в контроле 30,61%, при обработке БП 41,84%. На участке Спасского района, контрольные цифры всхожести составляли 40%, в опыте 58,33%. В целом всхожесть семян была низкая из-за неблагоприятных погодных условий 2024 года. В Спасском районе также хорошо взошли семена корейских красноплодных растений (66%). На второй сезон после обработки БП были измерены ростовые параметры растений и подсчитано количество завязавшихся семян (Рис. 2.1, 2.2). Наблюдалось увеличение количества растений с большим количеством листьев. Это может говорить об ускорении развития растений бактериями, находящимися в препарате, также, как и в случае зерновых культур. В 2024 году наблюдалась стимуляция плодоношения у растений Хасанской популяции, в то время как на гистограмме мы наблюдаем снижение завязываемости семян. Такое значение, вероятно, не достоверно, т.к. у двух растений Синегорской популяции погибли цветоносы с уже сформированными семенами в количестве 31 и 36 шт (Рис. 2б). В конце сентября 2024 года были выкопаны корни СГ популяции и получены морфометрические данные корней. На участке, обработанном БП наблюдалось увеличение веса и длины корней, увеличивалось количество боковых корешков (Рис. 2.3). С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии был проанализирован состав основных вторичных метаболитов – гинзенозидов. Хроматографическое и масс-спектрометрическое поведение основных стандартов гинзенозидов и самих метаболитов было представлено ранее (Горпенченко и др., 2023). Всего было обнаружено и проанализировано 22 вещества (Рисунок 3.1, 3.2, Таблица 3.1). В контроле суммарное количество гинзенозидов было 10,98 мг/г сухого веса, в опыте суммарное количество веществ равнялось 25,27 мг/г сухого веса. Продолжились опыты по выделению чистых бактериальных культур штаммов ризосферной почвы корней женьшеня растущих в лесу; на грядках; и грядках, обработанных БП. Всего было выделено и сохранено 61 штамм бактерий. Данные, основанные на морфологическом анализе и секвенированных последовательностях 16S ДНК, показали, что штаммы принадлежали к трем доминирующим филумам: Bacillota, Pseudomonadota и Actinomycetota. В то же время соотношение филумов, содержащих изолированные культивируемые штаммы в ризосферной почве из леса и ризосферных образцах с участков, было сопоставимым (53,6%, 28,6%, 17,8%) и (60%, 15%, 25%), соответственно. Различия наблюдались на уровне родов каждого филума (Рисунок 4.1а). Основное различие наблюдалось в штаммах, принадлежащих филуму Pseudomonadota, за счет К солюбилизирующей группы. В то же время выделить культивируемые штаммы родов этого филума относящихся к этой группе из почв грядок не удалось. Численность микроорганизмов группы солюбилизации калия также уменьшилась на грядках (Рисунок 4.2б). При этом в почвах леса наблюдался недостаток как общем, так и в доступном К по сравнению с грядками (Таблица 5.2, 5.4). Что возможно связано с активным потреблением данного элемента лесной растительностью. В основном культивируемые штаммы бактерий, способные к минерализации азота принадлежали к двум филумам Actinomycetota и Bacillotа. При этом отмечено, что количество бактерий группы минерализации азота в лесной почве было в 25 раз больше, чем на почвах грядок (Рисунок 4.1б). Содержание доступного фосфора в лесу было очень низким по сравнению с его количеством на грядках. Все фосфатсолюбилизирубющие штаммы бактерий были отнесены к двум филумам Bacillota и Pseudomonadota. Уровень общего азота практически не отличался в лесу и на грядках, в то время как количество доступного азота на грядках значительно снижалось по сравнению с лесом. Изменения в филлуме Bacillota, штаммы которых преобладали в этой функциональной группе, несмотря на высокую представленность в обоих образцах касались рода Bacillus. Среди культивируемых штаммов интересны редкие штаммы, отсутствующие на грядках, принадлежащие к основным функциональным группам, поскольку они дают возможность управлять, а во многих случаях и возрождать микробиом леса и подстилки (Рисунок 4.3). Все последовательности отобранных штаммов занесены в базу данных SRA NCBI (к примеру: Achromobacter sp 50S1NF-PQ659770; Ensifer sp 49S1NM-PQ659772 и др.).  Также одновременно с измерениями морфометрических параметров растений, было исследовано количество грибов и бактерий различных функциональных групп на контрольном и опытном участках грядок (Рисунок 4.2). Анализ количества колоний на специализированных средах выявил увеличение активности микробиома не только ризосферных почв, но и экзосферы корней женьшеня. Необходимо отметить, что бактериальный штамм оказал стимулирующий эффект не только на бактерии основных функциональных групп в ризосферных почвах, но и на активность грибов. В то время как активность грибов экзосферы корней из почв, обработанных бактериальным препаратом (БП) имела обратный эффект – снижалась. Наибольший эффект БП оказал на группу аммонификаторов (разложения азотсодержащих соединений) и азотфиксаторов (фиксация молекулярного атмосферного азота). Исходя из результатов, при обработке БП количество бактерий в грядках увеличивается, но не доходит до значений в лесной почве (Рисунка 4.1, 4.2). Образцам почвы и грядкам присвоили названия согласно основным крупным популяциям и изменили нумерацию для удобства обсчёта и анализа согласно литературе (Журавлев и др., 2008). Повторно было взято 11 образцов почвы на которых произрастали растения женьшеня (Таблица 5.1) и были добавлены пробы почв: №12 – почва грядки со старыми растениями Синегорской популяции из Чугуевского района (BM(Sh)-O) обработанные бактериальным препаратом; №13 - почва грядки с молодыми растениями Синегорской популяции (BM(Sh)-Y) обработанные бактериальным препаратом; №14 - почва грядки без растений подготовленная для посадки (BM(Sh)-F). Реакция среды почвенного раствора (рН) определялась в соответствии с рекомендациями ГОСТ 26423-85 и ГОСТ 26583-85. В 2024 году были повторно замерены показатели кислотности. Интересно, что все тенденции сохранились, не смотря на некоторое изменение в показателях. Основная масса образцов почв грядок (№3, 4, 5, 7-11) имела все такую же слабокислую реакцию среды с небольшим повышением. К этим образцам приблизилось значение образцов почв из-под старых красноплодных растений из Кореи (KoR-O). В нашем исследовании SОМ (гумус) незначительно отличался между лесом и грядками и не зависел от рН почвы (Рисунок 5.1). У всех образцов было измерено количество доступных форм основных элементов P, N и (Таблица 5.4). Значения доступного фосфора и калия были низкими в лесных почвах и грядках. Вероятно, высокие значения SOM на грядках со старыми растениями связаны с установлением баланса доступных форм углерода.  Элементный состав почвенных образцов определялся методом энергодисперсионной рентгенфлуоресцентной спектроскопии (EDX). Среднее содержание элементов, рассчитанное из значений, полученных для 3-х аналитических повторностей измерения каждого опытного почвенного образца приведено в Таблицах 5.1; 5.2. На всех участках содержание макроэлементов в образцах почв соответствует уровню содержания элементов в верхней части профилей буроземных почв (Dystric Cambisol), развитых на основных породах в естественных ландшафтах регионов исследования. В 2024 году содержание MgO, Al2O3, P2O5, K2O, MnO в ризосферных почвах было ниже в лесных образцах, чем на обрабатываемых участках (Таблица 5.1).  Было обнаружено, что почвы, отобранные с лесных участков, имеют микроэлементный состав, типичный для почв, сформированных в естественных ландшафтах исследуемого региона (Таблица 5.2). Содержание V, Ni, Co, Zr и Mo в почвах участков соответствовало таковому в верхних горизонтах лесных почв. Основным отличием в микроэлементном составе также, как и в предыдущий год, между исследованными образцами почв было увеличение содержания Cu в почвах участков. Результаты показали, что общее содержание Cu в почвах участков Спасского района было в выше, чем в лесных почвах и в почвах Чугуевского района, но ниже чем показатели 2023 года. Анализ элементного состава корней не выявили превышения наличия меди в корнях с грядок (Таблица 5.5). Кроме того, этот результат свидетельствует о том, что накопление Cu в почвах участков представляет собой экологический риск для почвенной среды. Содержание Zn, Rb и Pb в большинстве образцов почв участков оказалось выше, чем в лесных почвах. В Чугуевском районе таких высоких значений микроэлементов не наблюдалось (Таблица 5.3).