ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН

Форма «Т». Титульный лист отчета о выполнении проекта Название проекта: Адаптивная эволюция, филогения и популяционная структура холодоустойчивых хирономид (Diptera: Chironomidae) Номер проекта: 23-24-00620 Код типа проекта: МОНГ(2022) Отрасль знания: 04 Фамилия, имя, отчество (при наличии) руководителя проекта: Семенченко Александр Анатольевич Контактные телефон и e-mail руководителя проекта: +79242327278, semenchenko_alexander@mail.ru, semenchenko.aa@dvfu.ru Полное и краткое название организации, через которую осуществляется финансирование проекта: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр Биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии» Дальневосточного отделения Российской академии наук ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН Объем средств, фактически полученных от РНФ в 2023 г.: 1500 тыс. руб. Год начала проекта: 2023 Год окончания проекта: 2024 Объем финансирования*, запрашиваемый на 2024 год: 1500 тыс. руб. * Не может превышать объем средств, указанный на соответствующий год в соглашении между Российским научным фондом, руководителем проекта и организацией о предоставлении гранта на проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований, дополнительных соглашениях к данному соглашению (далее – соглашение). Гарантирую, что при подготовке отчета не были нарушены авторские и иные права третьих лиц и/или имеется согласие правообладателей на представление в РНФ материалов и их использование РНФ для проведения экспертизы и для их обнародования. Подпись** руководителя проекта ______________________/А.А. Семенченко/ Подпись** руководителя организации*** ________________/__________________________________________ / Печать (при наличии) организации Дата подачи отчета: 12.12.2023 г. ** Подписи должны быть расшифрованы. *** Либо уполномоченного представителя, действующего на основании доверенности или распорядительного документа. В случае подписания Формы уполномоченным представителем организации (в т.ч. – руководителем филиала) к печатному экземпляру отчета прилагается копия распорядительного документа или доверенности, заверенная печатью организации (при наличии). Проект № 23-24-00620/2023 Страница 1 из 19Форма 1о Отчет о выполнении проекта № 23-24-00620 «Адаптивная эволюция, филогения и популяционная структура холодоустойчивых хирономид (Diptera: Chironomidae)», в 2023 году Номер регистрации сведений о начинаемой научно-исследовательской работе в единой государственной информационной системе учета научно-исследовательских, опытноконструкторских и технологических работ гражданского назначения (rosrid.ru): В соответствии с Постановлением Правительства Российской Федерации от 12 апреля 2013 г. № 327 «О единой государственной информационной системе учета научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ гражданского назначения». 123022000021-5 1.1. Заявленный в проекте план работы научного исследования на отчетный период Формируется в соответствии с заявкой на участие в конкурсе. 1) Выделить ДНК порядка 120 особей хирономид, принадлежащих к подсемействам Diamesinae, Prodiamesinae и Orthocladiinae, а также ряд внешних групп, относящихся к Tanypodinae, Podonominae и Chironominae. С использованием полуавтоматического секвенатора ABI 3130XL, получить последовательности для двух генов мтДНК – COI и COII, для большой и малой субъединицы рибосом (28S рДНК и 18S рДНК), а также для карбамоилфосфат-синтетазы (CADI, CADIV). Выбор участков для секвенирования определен работой Кранстона с соавторами (Cranston et al., 2012), в которой получены последовательности этих локусов соответствующих групп хирономид из Южного полушария. 2) Выделить тотальную ДНК для 180 особей Pagastia orientalis, собранных в 24 точках северо-восточной Азии. Получить ампликоны и последовательности нуклеотидов для цитохромоксидазы 1 и 2 (COI, COII) мтДНК, а также внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК. Планируется командировка А.Б. Крашенинникова из Перми во Владивосток и обратно для реализации проекта. Экспедиции не предусмотрены. 1.2. Заявленные научные результаты на конец отчетного периода Формируется в соответствии с заявкой на участие в конкурсе. 1) Будут реконструированы филогенетические связи хирономид подсемейств Diamesinae, Prodiamesinae и Orthocladiinae, а также показано положение подсемейства на общем стволе Chironomidae. С использованием BEAST2 получена байесовская хронограмма хирономид, включающая представителей 7 подсемейств: Diamesinae, Tanypodinae, Podonominae, Orthocladiinae, Telmatogetoninae, Prodiamesinae и Chironominae. Будет выполнено сравнение полученной топологии с морфологическими представлениями об эволюции подсемейства. Результаты будут оформлены в виде статьи, а также доложены на конференции The 21st International Symposium on Chironomidae в Японии (Tsukuba, лето 2022 г.). 2) Будет дана оценка генетического разнообразия и получена популяционная структура вида Pagastia orientalis. Показана степень репродуктивной изолированности каждой популяции, даны предположения об истории формирования ареала и микроэволюционных процессах вида. 1.3. Сведения о фактическом выполнении плана работы в отчетный период (фактически проделанная работа, от 3 до 10 стр.) В ходе научного исследования 2023 года были были получены последовательности нуклеотидов хирономид принадлежащих к подсемейству Diamesinae, а также ряда внешних групп, относящихся к Prodiamesinae, Orthocladiinae, Tanypodinae, Telmatogetoninae, Podonominae и Chironominae с использованием полуавтоматического секвенатора ABI 3130XL. Целевыми участками выступили два гена мтДНК – COI (COI-5P и СOI-3P) и COII суммарной длиной 2168 п.н., большая и малая субъединица рибосом 18S рДНК и 28S рДНК суммарной длиной после выравнивания 6876 п.н. и Проект № 23-24-00620/2023 Страница 2 из 19карбамоилфосфат-синтетаза CADIV длиной 759 п.н. Суммарно данные последовательности получены для 89 особей хирономид, большая часть которых относится к подсемейству Diamesinae. Помимо капиллярного секвенирования мы использовали секвенатор следующего поколения, с использованием которого было получены сходные последовательности еще для 13 особей хирономид. Широкий набор сырых ридов, не используемый в работе по филогении хирономид ляжет в основу будущих исследований. Среди диамезин, охвачены такие роды как Boreoheptagyia, Kaluginia, Palatovia, Shilovia (триба Boreoheptagyiini), Arctodiamesa, Diamesa, Lappodiamesa, Pagastia, Potthastia, Pseudodiamesa, Sympotthastia, Syndiamesa (триба Diamesini), Linevitshia, Protanypus (триба Protanypodinae). Как минимум два вида от каждого рода использованы в анализе, а для политипических родов Boreoheptagyia, Pseudodiamesa и Diamesa получены данные для 8-38 видов. Все указанные последовательности были собраны и опубликованы в генном банке. Помимо наших данных в работе использованы данные для 36 особей хирономид, настоящих мокрецов (Ceratopogonidae) и кровососущих комаров (Culicidae) для реконструирования филогенетических деревьев. Среди подсемейства Diamesinae были использованы представители таких родов как Harrisonina (триба Harrisonini), Heptagyia, Limaya, Maoridiamesa, Mapucheptagyia, Paraheptagyia (триба Heptagyiini). Для полученного набора данных реконструировано три филогенетических дерева. Два дерева построены с использованием Байесовского моделирования (в программе MrBayes, Ronquist et al. 2012) и максимального правдоподобия (в программе IQTREE, Minh et al., 2020) и отражают точную филогению хирономид с максимальным уровнем поддержек для большинства узлов. Третье дерево является хронограммой, построено в программе BEAST (Bouckaert et al., 2019) с использованием ряда калибровочных точек по палеонтологическим находкам и отражает хронологию дивергенции подсемейств, родов и видов хирономид на геохронологической шкале. Реконструкция исторических ареалов выполнена в программе RASP (Yu et al., 2015) c использованием модели BAYAREALIKE+J. Ареалы хирономиды были взяты в каталоге Эш и Коннора (Ashe, Connor 2009) с дополнительным разделением Палеарктики на Западную и Восточную для более точного биогеографического анализа. В силу неполного набора видов для каждого рода, используемого в работе, мы также выполнили анализ биоразнообарзия всех известных диамезин раздельно для каждого биогеографического региона (Восточная и Западная Палеарктика, Ориентальный регион, Неарктика, Неотропика, Афротропика, Австралазия), расчитали долю видов в каждом регионе, число родов, видов, эндемичных и субэндемичных видов, а также число общих родов и видов между всеми регионами. Полученные данные легли в основу публикации "A multi-locus phylogeny for the Diamesinae (Chironomidae: Diptera) provides new insights into evolution of an amphitropical clade", со ссылкой на финансирование РНФ, находящейся на рецензировании в журнале Zoological Journal of the Linnean Society. В ходе подготовки рукописи по филогении хирономид, было принято решение о ревизии нескольких групп хирономид и публикации ряда новых для науки видов. Одна из работ посвящена ревизии подсемейства Prodiamesinae (Diptera: Chironomidae), собранных на Дальнем Востоке России и в Восточной Сибири. В этом семействе была описан новых вид Monodiamesa fontinalis sp. nov., а также переописано десять видов из четырех родов — Monodiamesa bathyphila Kieffer, M. kamora Makarchenko et Yavorskaya, M. improvisa Makarchenko, M. nitida Kieffer, Odontomesa fulva Kieffer, Prodiamesa levanidovae Makarchenko, Propsilocerus amurensis Makarchenko, P. jacuticus (Zvereva), P. paradoxus Lundström и P. taimyrus Zelentzov. Для видов Monodiamesa fontinalis sp. nov., М. bathyphila, Prodiamesa olivacea и Propilocerus akamusi получены ДНК баркоды, длиной 618-657 п.н., для которых совместно с последовательностями из генного банка реконструировано генетическое дерево. Проведенный анализ разделения видов (species delimitation) с использованием подходов ASAP (Puillandre et al. 2021), mPTP (Kapli et al. 2017) и GMYC (Fujisawa, Barraclough 2013) подтвердили видовую самостоятельность используемых в работе видов. Работа "Review of subfamily Prodiamesinae (Diptera: Chironomidae) from the Russian Far East and bordering territory" опубликована в журнале Zootaxa со ссылкой на РНФ грант. Крупная ревизия также требуется для рода Pseudokiefferiella. Долгое время род считался монотипическим с одним видом Ps. parva (Edwards, 1932) с широким ареалом, охватывающем восточную и западную Палеарктику и Неарктику. Благодаря молекулярному штрихкодированию к настоящему времени установлено что род включает множество различных молекулярных таксономических единиц (mOTU), которые однако слабо различимы морфологически. Типовое местообитания Ps. parva находится в Шотландии, откуда ДНК баркоды отсутствуют в силу чего описание новых видов из западной Палеарктики затруднено. Перед глубокой ревизией рода, нами были описаны два новых вида, Ps. matafonovi sp. nov. и Ps. silinka sp. nov. обитающих в верхнем и среднем течении р. Амур. Для первого вида получены ДНК баркоды. Применив анализ разделения видов было показано, что род включает 10 (mPTP), 13 (ASAP, GMYC) или 14 (BOLD) молекулярных таксономических единиц, при этом Ps. matafonovi sp. nov. является самостоятельным видом по результатам ДНК баркодинга. Результаты были опубликованы в работе "Two new chironomid species of the genus Pseudokiefferiella Zavřel (Diptera: Chironomidae: Diamesinae) from the Amur River basin of Russia" в журнале Zootaxa со ссылкой на РНФ грант. Для изучения популяционно-генетической изменчивости были получены последовательности нуклеотидов для 236 особей вида Pagastia orientalis для COI-5P участка длиной 658 п.н. Для 142 и 150 из этих особей получены сиквенсы для Проект № 23-24-00620/2023 Страница 3 из 19участков COI-3P и COII длиной 821 и 671 п.н. соответственно. Внутренние транскрибируемые спейсеры 1 и 2 (ITS1, ITS2), планируемые в работе были исключены из анализа в силу внутригеномной изменчивости, которая приводит к инсерциям и делециям в первой половине ITS1, что приводит к обрыву реакции терменирующего синтеза. Хирономиды были объединены по следующим локализациям: Южное Приморье, Приморский край (р. Кедровая, р. Фроловка), Облучинский район, Еврейская автономная область (ключ Федоткий, ключ Бревенчатый, р. Бира, р. Большой Колоболок), Ольский район, Макаданская область (р. Ола, р. Дукча), Большехехцирский заповедник, Хабаровский край (р. Чирка, р. Половинка, руч. Шереметьевский), Анюйский национальный парк, Хабаровский край (р. Анюй, р. Пихца), КатонКарагайский район Восточно-Казахстанской области Казахстана.(р. Кельмес), г. Красноярск, р. Енисей (р. Березовка), Елизовский район, Камчатский край (р. Быстрая, р. Плотникова), Тугуро-Чумиканский район, Хабаровский край (р. Биранджа, р. Кутын, р. Иурский Итыли, р. Талим). Получены последовательности по крайней мере для 20 особей Pagastia orientalis от каждой локализации для получения репрезентативной выборки. Предварительный анализ показывает, что хирономиды делятся на северные и южные группировки, большая часть мутаций наблюдается внутри популяций, что указывает на низкую репродуктивную изоляцию. После получения оставшихся последовательностей для генов COI-3P и COII планируется подготовить публикацию, что для хирономид делается впервые. Множество исследований по сходной тематике посвящено кровососущим комарам (Culicidae) в связи с распространением заболеваний, опасных для человека и животных.

Форма «Т». Титульный лист отчета (итогового отчета) о выполнении проекта Название проекта Адаптивная эволюция, филогения и популяционная структура холодоустойчивых хирономид (Diptera: Chironomidae) Номер проекта 23-24-00620 Тип проекта: МОНГ Отрасль знания: 04 Фамилия, имя, отчество (при наличии) руководителя проекта: Семенченко Александр Анатольевич Контактные телефон и e-mail руководителя проекта: +79242327278 semenchenko_alexander@mail.ru, semenchenko.aa@dvfu.ru Полное и сокращенное наименование организации, через которую должно осуществляться финансирование проекта: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр Биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии» Дальневосточного отделения Российской академии наук ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН Год начала проекта: 2023 Год окончания проекта: 2024 Руководитель проекта и Организация гарантируют, что при подготовке отчета не были нарушены авторские и иные права третьих лиц и/или имеется согласие правообладателей на представление в РНФ материалов и их использование РНФ для проведения экспертизы и для их обнародования. В соответствии с Соглашением о признании простой электронной подписи равнозначной собственноручной подписи Организация обеспечила подписание отчета простой электронной подписью руководителя проекта в Информационноаналитической системе РНФ в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет». Подпись руководителя организации Либо уполномоченного представителя (в т.ч. – руководителем филиала), действующего на основании доверенности или распорядительного документа. В этом случае к представляемому в Фонд печатному экземпляру отчета прилагается копия распорядительного документа или доверенности, заверенная печатью организации (при наличии). Подпись должна быть расшифрована. Форма может быть подписана квалифицированной электронной подписью уполномоченного работника организации с представлением в ИАС файла, содержащего информацию об электронной подписи уполномоченного работника организации (координатора организации (при наличии соответствующей ранее представленной в Фонд доверенности) или руководителя организации).В указанном случае представление отчета в печатном виде в Фонд не требуется. _____________________ /_____________________________ / Печать (при наличии) организации Дата регистрации отчета руководителем проекта 11.12.2024 К отчету прилагаются (прошиваются в составе бумажной версии отчета) копии всех публикаций* по проекту. *К печатному экземпляру отчета прикладываются только копии первой (с указанием авторов) страницы и страницы со ссылкой на поддержку от РНФ.Проект № 23-24-00620 Страница 2 из 48 Форма 1о Отчет о выполнении проекта № 23-24-00620 «Адаптивная эволюция, филогения и популяционная структура холодоустойчивых хирономид (Diptera: Chironomidae)» в 2024 году Номер регистрации сведений о начинаемой научно-исследовательской работе в единой государственной информационной системе учета научно-исследовательских , опытноконструкторских и технологических работ гражданского назначения (rosrid.ru): В соответствии с Постановлением Правительства Российской Федерации от 12 апреля 2013 г. № 327 «О единой государственной информационной системе учета научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ гражданского назначения». 123022000021-5 Приоритетное направление научно-технологического развития, критическая технология, сквозная технология Указывается согласно перечню (Указ Президента Российской Федерации от 18 июня 2024 г. № 529 «Об утверждении приоритетных направлений научно-технологического развития и перечня важнейших наукоемких технологий») в случае, если тематика проекта может быть отнесена к одному из приоритетных направлений, а также может внести вклад в развитие критических и/или сквозных технологий. 7. Адаптация к изменениям климата, сохранение и рациональное использование природных ресурсов. 21. Технологии сохранения биологического разнообразия и борьбы с чужеродными (инвазивными) видами животных, растений и микроорганизмов. Направление из Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации (далее – Стратегия НТР РФ) Утверждена Указом Президента Российской Федерации от 28 февраля 2024 г. № 145 «О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации». Н4 переход к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству, разработка и внедрение систем рационального применения средств химической и биологической защиты сельскохозяйственных растений и животных, хранение и эффективная переработка сельскохозяйственной продукции, создание безопасных и качественных, в том числе функциональных, продуктов питания Тематика проекта соответствует направлению профильной деятельности организации Да Описание. Организация реализует государственное задание Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 124012400285-7) «Биоразнообразие и ресурсный потенциал наземной биоты Восточной Азии». 1.1. Заявленный в проекте план работы научного исследования на отчетный период Формируется в соответствии с заявкой на участие в конкурсе 1) К настоящему времени получены последовательности нуклеотидов для 236 особей вида Pagastia orientalis для COI-5P участка длиной 658 п.н. Для 142 и 150 из этих особей получены сиквенсы для участков COI-3P и COII длиной 821 и 671 п.н. соответственно. В 2024 году планируется получить недостающие последовательности нуклеотидов для 86 и 94 особей Pagastia orientalis дляПроект № 23-24-00620 Страница 3 из 48 двух генов, COI-3P и COII соответственно. Использовать запланированные внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 не планируется в силу внутригеномной изменчивости, выявленной примерно для 20% особей Pagastia orientalis. 2) Предварительные данные с использованием полной митохондриальной ДНК (Lin et al., 2021) показывают, что род Potthastia занимает базальное положение для подсемейства Diamesinae, тогда как Boreoheptagyia + Sympotthastia является сестринской по отношению к Diamesa (Pagastia + Pseudodiamesa), что противоречит как результатам наших исследований, так и морфологическим данным. Это можент быть связано с неполной сортировкой филогенетических линий, интрогрессией митохондриальной ДНК или гибридизацией хирономид на границе ареалов. В ходе подготовки публикации по филогении хирономид, мы получили сырые данные для 13 особей хирономид (Chironomus sp., Boreoheptagyia sp.5, Pagastia orientalis, Pagastia nivis, Protanypus caudatus, Pseudodiamesa sp.2, Sympotthastia sp., Syndiamesa nigra, Heterotrissocladius sp., Hydrobaenus laticaudus, Orthocladius sp., Monodiamesa bathyphila, Prodiamesa olivacea) с использованием NGS секвенатора Ion S5. Из этих данных нами были собраны сравнительно небольшие участки митохондриальной ДНК (COI, COII) и гены большой и малой субъединиц рибосом 18S рДНК и 28S рДНК. В 2024 году планируется собрать полную мтДНК секвенированных в 2023 году хирономид, получить сырые NGS данные для таких родов как Arctodiamesa, Lappodiamesa, Palatovia, Pseudokiefferiella и Sasayusurika и дабавить последовательности из генного банка. Помимо использования NGS секвенатора, предполагается использовать капиллярный секвенатор для прочтения AT богатого региона мтДНК хирономид, сборка которого затруднена. Мы предполагаем, что использование широкого набора внешних групп из таких подсемейств как Prodiamesinae, Orthocladiinae и Telmatogetoninae, позволит более точно реконстиировать филогенетические связи, а сравнение различных данных позволит уточнить причины несовпадения топологии, полученной с использованием мтДНК и мультилокусного подхода. 3) Smittia brevipennis (Boheman, 1856) - это необычный партеногенетические короткокрылый вид комаров-звонцов, чей циркумареал ограничен высокоширотной Арктикой. В связи с неспособностью к полету, вероятной афагией имаго личинками, обитающими в увлажненной почве и выдерживающими засоление, этот вид очень интересен в плане выяснения механизмов заселения архипелагов Северного Ледовитого океана. Типовое местообитание находится на архипелаге Шпицберген, в генном банке также есть особи, собранные в Китикмеот (Канаде) и Аляске (США). Планируется получить последовательности нуклеотидов для хирономид, собранных на архипелаге Земля Франца-Иосифа и о. Визе, сравнение данных с другими точками ареала для выдвижения гипотез о механизмах заселения архипелагов Северного Ледовитого океана. 4) Выделить ДНК для четырех видов хирономид: холодоустойчивого Tokunagaia rectangularis (Земля Франца Иосифа), теплолюбивого Pagastia orientalis (Южное Приморье), высокогорного Diamesa caucasica (республика Северная Осетия) и галофильного Telmatogeton japonicus (Каспийское море). Тотальную ДНК каждой особи секвенировать на платформе Illumina (PE150). Для полученных ридов, будут собраны белки аквапорины всех типов (DRIP, PRIP, BIB, RPIP, LHIP) с последующим подсчетом их GC оснований и включением новых таксономических единиц в филогенетическое дерево аквапоринов насекомых. Будут собраны и подсчитаны транспозоны, а также посчитано соотношение GC оснований в выборке белок-кодирующих генов.Проект № 23-24-00620 Страница 4 из 48 1.2. Заявленные научные результаты на конец отчетного периода Формируется в соответствии с заявкой на участие в конкурсе 1) Получить последовательности нуклеотидов для 236 особей хирономид Pagastia orientalis для двух генов мтДНК, COI и COII суммарной длиной 2150 пар нуклеотидов. Объединить популяции по группам в соответствии с локализациями: Южное Приморье, Приморский край (р. Кедровая, р. Фроловка), Облучинский район, Еврейская автономная область (ключ Федоткий, ключ Бревенчатый, р. Бира, р. Большой Колоболок), Ольский район, Макаданская область (р. Ола, р. Дукча), Большехехцирский заповедник, Хабаровский край (р. Чирка, р. Половинка, руч. Шереметьевский), Анюйский национальный парк, Хабаровский край (р. Анюй, р. Пихца), Катон-Карагайский район Восточно-Казахстанской области Казахстана.(р. Кельмес), г. Красноярск, р. Енисей (р. Березовка), Елизовский район, Камчатский край (р. Быстрая, р. Плотникова), Тугуро-Чумиканский район, Хабаровский край (р. Биранджа, р. Кутын, р. Иурский Итыли, р. Талим). Использовать программу DnaSP для анализа молекулярного разнообразия: количество гаплотипов, частота гаплотипов, количество полиморфных сайтов, гаплотипическое разнообразие, нуклеотидное разнообразие и среднее количество нуклеотидных различий. Оценить молекулярную дисперсию в программе AMOVA. Установить характер мутаций в программе Arlequin, рассчитать долю мутаций между локализациями, между популяциями внутри каждой локализации, между отдельными особями внутри каждой популяции. Предварительный анализ показывает, что хирономиды делятся на северные и южные группировки, большая часть мутаций наблюдается внутри популяций, что указывает на низкую репродуктивную изоляцию. После получения и обработки последовательностей нуклеотидов, планируется реконструировать генеалогию митохондриальных гаплотипов и установить популяционно-генетическую структуру Pagastia orientalis. Планируется подготовить соответствующую публикацию со ссылкой на финансирование РНФ. 2) Собрать полную митохондриальную ДНК для 13 особей хирономид (Chironomus sp., Boreoheptagyia sp.5, Pagastia orientalis, Pagastia nivis, Protanypus caudatus, Pseudodiamesa sp.2, Sympotthastia sp., Syndiamesa nigra, Heterotrissocladius sp., Hydrobaenus laticaudus, Orthocladius sp., Monodiamesa bathyphila, Prodiamesa olivacea) из сырых данных, полученных в ходе эксперимента в 2023 году на секвенаторе Ion S5. Секвенировать AT богатый регион этих особей с помощью капиллярного секвенатора ABI 3500. Получить последовательности мтДНК для родов Arctodiamesa, Lappodiamesa, Palatovia, Pseudokiefferiella и Sasayusurika. Добавить к полученным данным последовательности из генного банка. Реконструировать филогенетические связи с использованием Байесовского моделирования (в программе MrBayes) и максимального правдоподобия (IQTREE). Установить причины расхождения топологии, полученной на основании мультилокусного подхода в 2023 г и митохондриальной ДНК, полученной Лин с соавторами (Lin et al., 2021). Предположить наличие интрогрессии, неполной сортировки филогенетических линий или гибридизации на границе ареалов в ходе эволюции хирономид. Планируется подготовить соответствующую публикацию со ссылкой на финансирование РНФ. 3) Получить ДНК баркоды для Smittia brevipennis собранных на архипелаге Земля Франца-Иосифа и о. Визе. Сравнить особи с хирономидами, собранными на архепилаге Шпицберген, в Китикмеот (Канаде) и Аляске (США). Выдвинуть гипотезы о механизмах заселения архипелагов Северного Ледовитого океана в связи с неспособностью к полету имаго насекомых. Подготовить соответствующуюПроект № 23-24-00620 Страница 5 из 48 публикацию со ссылкой на финансирование РНФ. 4) Секвенировать тотальную ДНК для четырех видов хирономид: холодоустойчивого Tokunagaia rectangularis (Земля Франца Иосифа), теплолюбивого Pagastia orientalis (Южное Приморье), высокогорного Diamesa caucasica (республика Северная Осетия) и галофильного Telmatogeton japonicus (Каспийское море) на платформе Illumina (PE150). Собраны белки аквапорины всех типов (DRIP, PRIP, BIB, RPIP, LHIP) с последующим подсчетом их GC оснований и включением новых таксономических единиц в филогенетическое дерево аквапоринов насекомых. Будут собраны и подсчитаны транспозоны, а также посчитано соотношение GC оснований в выборке белок-кодирующих генов. Результаты планируется обнародовать после 2024 года. 1.3. Сведения о фактическом выполнении плана работы на год (фактически проделанная работа, от 3 до 10 стр. (6-20 тыс. символов)) 1) В конце 2023 года была подготовлена и отправлена в журнал Zoological Journal of the Linnean Society публикация "A multi-locus phylogeny for the Diamesinae (Chironomidae: Diptera) provides new insights into evolution of an amphitropical clade". Эта публикация была принята к печати, однако ее рецензирование, исправление графических материалов продлилось вплоть до мая 2024 года. В ходе подготовки публикации было принято решение о сужении обсуждения выявленных филогенетических связей до анализа подсемейства Диамезин. Техническая редакция коснулась изменения масштабов рисунков, таблиц, были исправлено множество недочетов, связанных точностью англоязычных формулировок, ссылок на литературу и т.д. 2) В связи с высоким числом образцов и четырьмя запланированными молекулярными маркерами, на 2024 год была перенесена работа по оценке генетического разнообразия и популяционная структура вида Pagastia orientalis (Tshernovskij, 1949). В 2023 году было запланировано выделить тотальную ДНК для 180 особей Pagastia orientalis, собранных в 24 точках северо-восточной Азии. Получить ампликоны и последовательности нуклеотидов для цитохромоксидазы 1 и 2 (COI5P, COI3P, COII) мтДНК, а также внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) рибосомной ДНК. После получения нового материала, в начале 2024 года, а также в ходе проведения лабораторных молекулярно-генетических исследований, число особей возросло до 213 при сохранении 24 точек мест сбора проб. Ряд точек сбора были объединены в один локалитет, каждый из которых должен был включать 20 и более особей хирономид. Всего было выделено 10 локалитетов: 1. Южное Приморье, 2. бассейн р. Биджан, 3. Магадан, 4. Большехехцирский заповедник, 5. Восточный Казахстан, 6. Енисей близ г. Красноярск, 7. п-ов Камчатка, 8. бассейн р. Бира, 9. ТугуроЧумиканский район и 10. бассейн р. Амгунь. В ходе секвенирования было установлено, что в двух точках вдоль последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) у 32% Pagastia orientalis возникает внутригеномные инделы, которые приводят к наложению пиков на хроматограммах. При этом, анализ оставшихся сиквенсов показал, что участки ITS1 и ITS2 включают 5 полиморфных сайтов при длине 1200 п.н. По указанным причинам причинам, внутренние транскрибируемые спейсеры были исключены из анализа. Оставшиеся гены, COI5P, COI3P, COII были сконкатернированы для каждой особи, которые в свою очередь были сгруппированы в соответствии с локалитетами. Для каждого из них было расчитано число гаплотипов и полиморфных сайтов, оценено гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие, а также среднее число нуклеотидных различий и число полиморфных сайтов. Анализ гаплотипической сетиПроект № 23-24-00620 Страница 6 из 48 методом максимальной парсимонии показал, что особи подразделяются на три гаплогруппы, первая (H1) включала предковые гаплотипы, представленные большинством гаплотипов из Южного Приморья. Вторая гаплогруппа (H2), имела хорошо выраженную звездообразную филогению, включала в основном особи, собранные с западных границ ареала - из Енисея близ Красноярска, бассейна р. Биджан и Восточного Казахстана. Третья гаплогруппа (H3) была составлена преимущественно из гаплотипов, обнаруженных в выборках Магадана, Камчатки и Хабаровского края. Вопреки ожиданиям оказалось, что у хирономид слабо выражена географическая кластеризация. Результаты свидетельствуют о расширении популяции в недавнем прошлом, что нивелировало разницу между мутацией и генетическим дрейфом и позволило сохранить предковые гаплотипы. При этом в настоящее время наблюдается генетическая структурированность популяций, способная в будущем привести к изоляции субпопуляций и уменьшению их генетического разнообразия. Полученные популяционно-генетические результаты, а также морфологическое переописание Pagastia orientalis были опубликованы в журнале Zootaxa со ссылкой на проект РНФ под названием «Morphological redescription and population genetics of Pagastia (Pagastia) orientalis (Tshernovskij, 1949) (Diptera: Chironomidae: Diamesinae)» 3) Получены ДНК баркоды для холодоустойчивой партеногенетической бескрылой хирономиды подсемейства Orthocladiinae - Smittia brevipennis (Boheman, 1856) собранных на архипелаге Земля Франца-Иосифа и о. Визе. Выполнено сравнение особей с хирономидами, собранными на архепилаге Шпицберген, в Китикмеот (Канаде) и Аляске (США). Отсутствие внутривидовых мутаций в гене COI отмечено во всех популяциях, включая данные генного банка, что является уникальным явлением для хирономид, населяющих столь обширный ареал, что указывает на относительно недавнюю и быструю колонизацию высокоарктических районов. Предполагается, что хирономиды колонизировали острова благодаря переносу гнездового материала птицами моевками с материковой части Палеарктики. Возможным способом колонизации также является перенос личинок посредством дрейфа со льдом, включающим минеральные загрязнения, ил и наземный грунт. Результаты молекулярно-генетических исследований и биогеографических данных были поданы в журнал Polar Biology со ссылкой на проект РНФ в январе 2024 под названием «The mystery of distribution of Smittia brevipennis (Diptera, Chironomidae, Orthocladiinae)». К сожалению, спустя почти год работа получила только одну положительную рецензию из необходимых двух и находится в статусе «Preprint». 4) Нами собрано 18 новых митогеномов хирономид, принадлежащих к подсемействам Protanypodinae, Diamesinae, Prodiamesinae, Orthocladiinae и Telmatogetoninae. Полученные последовательности митохондриальной ДНК имели обычную последовательность генов для хирономид. Реконструированы филогенетические связи хирономид с использованием как новых митогеномов, так полуенных из генного банка. К анализу также добавлены 7 особей хирономид, собранных нами из транскриптомных сборок в виде сырых архивов (NCBI Sequence Read Archive). Хирономиды кластеризовались в соответствии с предыдущими мультилокусными филогениями, что показало пригодность митохондрий для филогении. При этом, было показано, что наилучший результат достигается только с использованием только 1 и 2 позиции кодонов белок-кодирующих генов и большой и малой субъединиц рибосомальной ДНК (18S и 28S рДНК), а также расширенного набора внешний групп. Работа была отправлена в профильный журнал Mitochondrial DNA Part B в июне 2024. В августе 2024 редакция сообщила, что журнал не может принять публикацию к печати в силу невозможности оплаты этой работы вПроект № 23-24-00620 Страница 7 из 48 издательство Taylor & Francis из Российской Федерации. Продолжающаяся переписка до сентября не дала результатов, работа была отклонена. В условиях ограниченного времени, нами было принято решение опубликовать один митогеном для литоральной хирономиды Telmatogeton sp. из Каспийского моря в журнале Far Eastern Entomologist под названием "Complete mitochondrial genome of Telmatogeton sp. (Diptera: Chironomidae) from the Caspian sea basin" со ссылкой на проект РНФ. Это первый опубликованный митогеном представителя подсемейства Telmatogetoninae. В работе была показана структура митогенома, а также реконструированы филогенетические связи с другими подсемействами. 5) В г. Санкт-Петербург, 21–24 октября 2024 г на XII Всероссийскиом диптерологическом симпозиуме А.А. Семенченко представил пленарный доклад под названием «Мультилокусная филогения хирономид подсемейства Diamesinae (Diptera, Chironomidae) выявила новые сведения об эволюции амфитропической клады». В докладе были представлены основные результаты, полученные в статье "A multi-locus phylogeny for the Diamesinae (Chironomidae: Diptera) provides new insights into evolution of an amphitropical clade". Доклад вызвал большой интерес у аудитории. Были налажены контакты с коллегами, а также получен материал по различным группам двукрылых насекомых. 6) Мы отправили на NGS секвенирование в компанию «Сербалаб» 3 особи хирономид: галофильную Telmatogeton sp. из бассейна Каспийского моря, высокогорную Diamesa caucasica из Северой Осетии, а также Pagastia orientalis из типового местообитания в р. Паратунка (п-ов Камчатка). На секвенаторе Illumina NovaSeq X Plus были получено 24-26 гигабайт парноконцевых сырых ридов для каждой особи. Холодоустойчивая Tokunagaia rectangularis с Земли Франца Иосифа была секвенирована на полупроводниковом секвенаторе Ion S5 с результатом – 36 гигабайт непарных сырых ридов. Качество сырых ридов было проверено с помощью программы FastQC (Andrews, 2010), после чего из данных были удалены адаптеры (Cutadapt, Martin 2011) и концевые участки прочтений низкого качества (Trimmomatic, Bolger et al., 2014). Подготовленные риды были собраны de novo посредством SPAdes (Prjibelski et al., 2020), качество контигов было оценено с помощью assembly_stats, а сравнительная характеристика однокопийных генов с эталонным набором для двукрылых насекомых была выполнена в программе Busco (Manni et al., 2021). Относительно высокое качество полученных данных позволит сравнить их с данными генного банка, выявить закономерности адапивной эволюции хирономид и подготовить соответствующие публикации. В 2024 году публикаций по полногеномным сиквенсам хирономид не планируется. Все планируемые на год работы выполнены полностью: Да 1.4. Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном году (от 1 до 5 стр. (2-10 тыс. символов)) 1) Выполнено морфологическое переописание и установлена популяционногенетическая структура Pagastia orientalis (Tshernovskij, 1949). Мы выявили 209 гаплотипов для 213 особей хирономид по сконкатинированным генам COI5P, COI3P и COII мтДНК. Результаты нашего исследования продемонстрировали высокий уровень гаплотипического разнообразия (1.00±0.00), большое число полиморфных сайтов (346) и достаточно низкий уровень нуклеотидного разнообразия (0.011±0.000) для всех собранных групп P. orientalis. Тесты на нейтральность Таджимы и Фу свидетельствуют о демографическом расширении популяции в прошлом из небольшого эффективного размера популяции (Joshi et al., 2014; SanalПроект № 23-24-00620 Страница 8 из 48 Demirci et al., 2021). Со временем, когда популяция перестает расширяться и начинает стабилизироваться, нуклеотидное разнообразие будет увеличиваться, поскольку вновь созданные низкочастотные гаплотипы либо увеличиваются в популяции, либо теряются (Avise, 2000). Построенная методом MP сеть гаплотипов показала, что географической кластеризации выборок не наблюдается, гаплотипы из географически удаленных районов могут отстоять друг от друга всего на несколько нуклеотидных замен. Пространственно-генетическая структурированность популяций Pagastia orientalis предполагает активное расселение особей. Несмотря на низкую способность к полету и привязанность к воде, расселение хирономид, по-видимому, связано перестройками речных систем, с гляциальными процессами, и колебаниями уровня Мирового океана в ПлиоценеПлейстоцене. 2) Показано необычное распространение холодоустойчивой партеногенетической бескрылой хирономиды подсемейства Orthocladiinae - Smittia brevipennis (Boheman, 1856). Эти хирономиды были собраны на архипелаге Земля ФранцаИосифа и о. Визе. Для особей из о. Визе были получены ДНК баркоды, которые были сравнены с особями из архепилага Шпицберген, Китикмеот (Канаде) и Аляске (США). Партеногенез для хирономид является приспособлением для выживания в тяжелых абиотических условиях (Lackmann et al., 2020). К настоящему времени известен 21 партеногенетический вид, при этом в ряде случаев известна как обоеполая популяция, обитающая в оптимальных для вида условиях, так и партеногенетические самки, обитающие на краевых участках. В случае Smittia brevipennis обоеполая популяция не известна, но предположительно обитает в районе Якутии, Чукотского автономного округа или Магаданской области. ДНК баркоды особей с о. Визе не отличимы от таковых из архепилага Шпицберген, Канады и Аляски, что говорит о недавнем формировании ареала этих популяций, что делает вид S. brevipennis уникальным учитывая ширину его ареала. Нами выдвинуты две основных гипотезы постоянной колонизации хирономид островных территорий от материковой части Евразии. Согласно первой, хирономиды колонизировали острова благодаря переносу гнездового материала птицами моевками с материковой части Палеарктики. Подтверждением этой гипотезы служат отмеченные на о. Визе личинки хирономид, обитающие исключительно среди гнездового материала под колонией моевок с численностью около 32 экз./м2 и биомассой — 16 мг/м2. Поскольку личинки S. brevipennis являются эвригалинными, то вторым возможным способом колонизации также является перенос личинок посредством дрейфа со льдом, включающим минеральные загрязнения, ил и наземный грунт. Вероятно, оба способа влияют на формирование хирономид, при этом лед является средством для переноса личинок на дальние расстояния, а птицами с гнездовым материалом – ближним. 3) Впервые был получен митогеном для хирономиды подсемейства Telmatogetoninae - Telmatogeton sp. из Каспийского моря длиной 15652 пн. ДНК баркодинг этой особи показал, что она конспецифична с хирономидами, собранными в США (близ г. Нью-Йорк) и Японии (Сирахама, Вакаяма). По мнению Танга с соавторами (Tang et al., 2022), этот вид является инвазивным, в силу чего имеет низкую внутривидовую изменчивость в различных частях Голарктики. Колонизация этим видом Каспийского моря, вероятнее всего связана со строительством ВолгоДонского канала в 1952 году, в результате чего проникли в бассейн Каспия посредством прикрепления к судам и гидротехническим сооружениям. Известно, что личинки Telmatogeton выдерживают значительное распреснение, включая пресную воду (Newman, 19588). Последовательность 13 белок-кодирующих генов, 22 участков транспортной РНК и 2 генов рибосомальной РНК соответствуетПроект № 23-24-00620 Страница 9 из 48 остальным хирономидам. Получив более 23 гигабайт парноконцевых ридов на Illumina NovaSeq X Plus, мы показали значительную неравномерность покрытия сырых ридов вдоль митохондриальной ДНК со значительным падением в районе АТ богатой контрольной области. Это объясняет множество пропущенных данных, или отсутствующую контрольную область в ряде митогеномов хирономид, депонированных в генном банке. Для успешного чтения полного митогенома нами рекомендуется синтезировать праймеры для 12S рРНК и гена ND2 для отдельного прочтения контрольной области с помощью капиллярного секвенирования. Положение подсемейства Telmatogetoninae на дереве хирономид остается неустановленным. Филогения, основанная на морфологических признаках, предполагает их сестринское положение с Diamesinae (Brundin, 1966), базальное положение всего семейства (Murray & Ashe, 1981, 1985, Sæther, 1977) или сестринское положение для Chironominae + Orthocladiinae (Ache & Connor, 2009). Филогения, основанная на молекулярно-генетических признаках, предполагает, что Telmatogetoninae является сестрой Diamesinae (Kutty et al., 2018) или занимают сестринское положение для полусемейства Chironomoinae (Cranston et al., 2010, 2012). Таким образом, Telmatogetoninae являются наиболее неустойчивым подсемейством хирономид на деревьях, полученных любым способом, включая транскриптомные данные (Kutty et al., 2018). Используя 13 белок кодирующих генов, а также гены рибосомальной РНК мы подтвердили топологию Эш и Коннора (Ache & Connor, 2009), однако апостериорная вероятность Байесовского моделирования и бутстреп поддержка максимально правдоподобного дерева составили менее 0.7 и 70% соответственно. Таким образом, полные последовательности митохондриальной ДНК не позволяют получить статистически поддержанную топологию хирономид, включающих подсемейство Telmatogetoninae. 4) Мы получили 24-26 гигабайт парноконцевых сырых прочтений для трех особей хирономид Telmatogeton sp., Diamesa caucasica и Pagastia orientalis на платформе Illumina NovaSeq X Plus и 36 гигабайт для одной особи Tokunagaia rectangularis на Ion S5. Качество полученных данных было проанализировано в программе FastQC (Andrews, 2010), которая выявила минимальное число дупликаций после ПЦР при высокой оценке остальных показателей. Минимальное число адаптеров были удалены в программе Cutadapt (Martin 2011) в соответствии с используемой платформой. После удаления концевых участков прочтений низкого качества (Trimmomatic, Bolger et al., 2014), прочтения были собраны в программе SPAdes (Prjibelski et al., 2020). Мы получили статистические значения N50 для скэффолдов длиной 5989 п.н., 16704 п.н., 7274 п.н. и 8148 п.н. для Telmatogeton sp., Diamesa caucasica и Pagastia orientalis и Tokunagaia rectangularis соответственно. В программе BUSCO был выполнен сравнительный анализ белок кодирующих генов с базой данных данных генов для двукрылых насекомых - diptera_odb100, который выявил 87.2%, 86.9%, 78.3 и 80.4 для 4 особей хирономид. Относительно высокие показатели качества сырых прочнений позволят в будущем собрать отдельные гены, связанные с приспособлениями к различным абиотическим факторам. В тоже время, у нас отсутствуют данных по РНК этих особей, в силу чего невозможно будет оценить уровень экспрессии этих генов в тех или иных условиях обитания хирономид. Из полученных ридов для всех особей были собраны митогеномы и ядерная рибосомнальная ДНК. Филогенетические связи показали что для Pagastia orientalis сестринским видом является Pagastia tianmumontana, для Diamesa caucasica - Diamesa loeffleri + (Diamesa tonsa + Diamesa qiangi), для Tokunagaia rectangularis - Cardiocladius sp. Филогения для Telmatogeton sp.Проект № 23-24-00620 Страница 10 из 48 дана в пункте 3