Роль природных трансгенов в формировании стрессоустойчивости и регуляции вторичного метаболизма растений
Впервые раскрыты механизмы действия генов природно-трансгенного, растения Ipomoea batatas. Показано, что ген rolB/C и новый, идентифицированный rolD-подобный ген не только способствуют активации вторичного метаболизма, но и стимулируют каскады защитных реакций, обеспечивающих устойчивость растений к стрессам. Эксперименты на модельных системах продемонстрировали, что ген rolB/C регулирует кальций-зависимые сигнальные пути, усиливая синтез антрахинонов. Его экспрессия приводит к снижению внутриклеточного уровня ионов Ca²⁺ и повышает транскрипцию специфических кальций-зависимых протеинкиназ. Новый rolD-подобный ген участвует в метаболизме пролина и ответе на неблагоприятные факторы внешней среды. Хотя rolD-подобный белок функционально близок своему агробактериальному гомологу, его экспрессия регулируется иначе, с участием стрессовых гормонов, таких как жасмоновая и салициловая кислоты.
Влияние экспрессии rolD-подобного гена на продукцию пролина и ферментативную активность трансгенного Arabidopsis. (A) Целевой анализ пролина в растительных экстрактах методом ЖХ-МС, показывающий хроматограммы выделенных ионов при m/z 116 ± 1 для пролина ([M+H]+). (Б) Спектры МС/МС стандартного раствора пролина.
Фенотипическая характеристика линий Arabidopsis, экспрессирующих rolD-подобный ген. (A) Фенотипы роста линий Arabidopsis дикого типа (WT) и линий, экспрессирующих rolD-подобный ген, в различные временные точки (19, 29, 36 и 43 дня после посадки). (Б) Морфологические различия в цветковых органах и стручках растений WT и трансгенных растений, подчеркивающие снижение семенной продуктивности и наличие трихом у At-rolD-подобных линий. (В) Анализ роста корней растений WT и At-rolD-подобных растений, выращенных вертикально на среде MS половинной концентрации в течение 10 дней.
Предсказанные трехмерные структуры OCD из A. tumefaciens, RolD из A. rhizogenes и RolD-подобного белка из I. batatas, иллюстрирующие структурное сходство.
Ферментативная активность RolD-подобного белка. (A) SDS-PAGE-анализ экспрессии рекомбинантного DsbC-RolD и DsbC-RolD-подобного белка в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysS. Экспрессию белка индуцировали 0,2 мМ IPTG и проводили в течение 18 ч при 16 ◦C. Каждая дорожка содержит 20 мкг общего клеточного лизата. Дорожка M представляет собой маркеры молекулярной массы (в кДа). Стрелки указывают на интересующие белки с их прогнозируемой молекулярной массой. (Б) Накопление НАДН в процессе ферментативного превращения орнитина в пролин, катализируемого орнитинциклодеаминазой (OCD). Продукцию НАДН контролировали спектрофотометрически при 340 нм.
Уровни экспрессии генов кальций-зависимой протеинкиназы (CDPK) в контрольных и экспрессирующих Ib-rolB/C каллусных культурах R. cordifolia. Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего. Разные буквы над столбиками обозначают статистически значимые различия средних значений для каждой изоформы CDPK (p < 0,05), наименьшее критерий (LSD) Фишера.
Относительные уровни экспрессии генов биосинтеза антрахинона (RcICS, RcOSBS, RcOSBL и RcIPPi) в нетрансформированных (R) и экспрессирующих Ib-rolB/C каллусных линиях R. cordifolia (RB/C5 и RB/C13). Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего. Разные буквы над полосами обозначают статистически значимые различия средних значений (p < 0,05), LSD Фишера.
Влияние дефицита и избытка кальция на рост и накопление антрахинона в контрольных и экспрессирующих Ib-rolB/C каллусных культурах R. cordifolia, выращенных на безкальциевых средах (А), а также на средах с избытком кальция (Б). Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего. Звездочки (*) или разные буквы указывают на статистически значимые различия средних значений (p < 0,05), t-критерий Стьюдента.
