Водясова Е.А., Челебиева Э.С., Шихат О.В., Атопкин Д.М., Дмитриева Е.В.
В журнале Вавиловский журнал генетики и селекции
Год: 2022 Том: 26 Номер: 3 Страницы: 290-297
Mugil cephalus L., 1758 (лобан) – ценная промысловая рыба и перспективный объект разведения в бассейнах Черного и Азовского морей. Изучение его паразитофауны крайне важно для рыбного промысла и марикультуры. Одними из массовых эктопаразитов, обитающих на жабрах кефалевых, являются моноге- неи рода Ligophorus. На лобане в Азово-Черноморском регионе паразитируют два представителя этого рода: Ligophorus mediterraneus Sarabeev, Balbuena et Euzet, 2005 и Ligophorus cephali Rubtsova, Balbuena, Sarabeev, Blasco-Costa et Euzet, 2006. Морфологическое определение этих видов весьма трудоемко и требует высокого уровня квалификации. Для быстрого и точного различия двух названных видов паразитов нами разработан метод, основанный на ПЦР вариабельных участков рибосомного гена 28S. Данный ген широко использует- ся для молекулярной таксономии рода Ligophorus. В настоящей работе применялись три подхода: анализ длины амплифицированных фрагментов, аллель-специфичная ПЦР с детекцией в конечной точке и аллель- специфичная ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. Первый подход заключался в подборе праймеров для получения ПЦР-продуктов различной длины, которые были характерны для L. mediterraneus или L. cephali. Этот подход был осуществлен благодаря наличию нескольких вариабельных локусов, которые находятся на расстоянии друг от друга. ПЦР-смесь содержала три прайме- ра: один прямой и два обратных. Прямой праймер был комплементарен консервативному участку, который не различался между видами. Обратные праймеры были видоспецифичны, при этом для каждого вида они были комплементарны различным участкам ДНК, которые расположены на удалении 100 п. н. друг от дру- га. В результате L. mediterraneus характеризовался более короткими ампликонами, чем L. cephali. Для второ- го и третьего подхода конструировалась пара праймеров по следующему принципу: прямой праймер был комплементарен обоим видам, так как подбирался к консервативному участку гена. Обратные праймеры были видоспецифичными и разрабатывались к вариабельному участку 28S. На этом участке два вида пара- зита различались тремя точечными мутациями. Таким образом, одна пара праймеров была комплементарна L. mediterraneus, вторая – L. cephali. Анализ длины амплифицированных фрагментов и аллель-специфичная ПЦР в реальном времени продемонстрировали 100 % совпадение результатов генотипирования при срав- нении с морфологической идентификацией и секвенированием по Сэнгеру. Разработанные протоколы гено- типирования могут быть использованы не только для различия обитающих на лобане двух видов Ligophorus при экологических исследованиях и в ветеринарной практике, но и для последующей разработки подобных методов для других моногеней, среди которых много патогенных видов.
